Le 21 avril, le gouvernement tchèque a adressé un ultimatum à la Russie, avertissant qu'il pourrait expulser davantage de diplomates russes si les diplomates tchèques expulsés de Moscou n'étaient pas autorisés à y retourner ce 22 avril à midi. La Russie a aussitôt rejeté cet ultimatum, estimant qu'un «tel ton à [son] égard est inacceptable», et suggérant à Prague de garder les ultimatums «pour les relations à l'intérieur de l'Otan».
La République tchèque a expulsé 18 diplomates russes et Moscou a riposté en expulsant 20 diplomates tchèques, à la suite d'accusations de Prague sur l'implication d'agents secrets russes dans une explosion mortelle en 2014 sur le sol tchèque. «La Fédération de Russie a jusqu'à 12h00 demain pour autoriser le retour de tous les diplomates expulsés de l'ambassade tchèque à Moscou», a déclaré aux journalistes le ministre tchèque des Affaires étrangères, Jakub Kulhanek.
«S'ils ne peuvent pas rentrer, je réduirai le nombre des membres du personnel de l'ambassade de Russie à Prague pour que cela corresponde à la situation actuelle à l'ambassade de République tchèque à Moscou», a-t-il ajouté. Des responsables tchèques – dont le ministre de l'Intérieur Jan Hamacek, qui a occupé le poste de chef de la diplomatie jusqu'à la nomination de Jakub Kulhanek – avaient déclaré le 20 avril qu'ils pourraient même expulser tous les diplomates russes en poste.
Nous suggérons que Prague garde les ultimatums pour les relations à l'intérieur de l'Otan
La Russie a aussitôt rejeté cet ultimatum, la porte-parole du ministère russe des Affaires étrangères Maria Zakharova s'étant exprimée en ces termes : «Nous suggérons que Prague garde les ultimatums pour les relations à l'intérieur de l'OTAN. Un tel ton à l'égard de la Russie est inacceptable». Elle a ajouté que l'ambassadeur tchèque serait convoqué ce 22 avril.
L'Union européenne (UE) a quant à elle exprimé le 21 avril dans la soirée sa «pleine solidarité» avec Prague. L'UE «soutient les mesures prises par les autorités» tchèques et «condamne la réaction disproportionnée et les menaces de la Fédération de Russie à l'égard de la République tchèque», a déclaré le chef de la diplomatie européenne, Josep Borrell. Prague avait demandé la veille à ses partenaires de l'UE et de l'Otan d'expulser des diplomates russes pour la soutenir dans sa confrontation avec Moscou.